ハーシー と チェイス の 実験。 遺伝子の正体

【高校生物の物語】ウイルスの仕組み【ハーシーとチェイスの実験も】

ハーシー と チェイス の 実験

へ移動します。 ハーシー・チェイスの実験 渡辺は言う。 「3か年計画を考えた事自体が誤りで、あの時、ただちにウイルス増殖の研究に突入するべきだった」。 最初に渡辺が計画したのは、ファージの増殖を決定付ける因子がDNAである事の証明。 「1944年(昭和19年)に発表されたエイブリーの肺炎双球菌の実験から遺伝子の本体がDNAである事は明白だったから、そんな寄り道をするべきではなかったのに」。 渡辺達はナイトロジェン・マスタードでファージのDNA合成を止めた時と、フォルマリンでタンパク質合成を止めた時の違いから、遺伝子の本体がどちらか結論しようと考えた。 「しかし、それが結論された時に、次に何をすべきかを考えてはいなかった」。 「日本という片田舎の高慢ちきな青二才の鼻柱は、1952年(昭和27年)に発表されたアルフレッド・ハーシーとマーサ・チェイスの論文で無残に打ち砕かれた。 放射性アイソトープを使って、ファージが大腸菌に感染する時、DNAだけが中に入ってタンパク質は外に残る事を証明したのだ」。 リン原子は核酸にしか存在せず、イオウ原子はタンパク質にしかない。 二種の放射性アイソトープを使いわければ、どちらかだけを標識する事ができる。 大腸菌の中に入るのは、リン、すなわちDNAで、イオウ、すなわちタンパク質ではなかった。 ボーアや仁科達がはじめたトレーサー実験は、こんな革新的な結論を生んだのだ。 後に渡辺がワトソンに会った時、「研究する必要がなくなった時になって、どうしてウイルス増殖機構を研究しようとしたのか」と問われて、「返事に窮した」。 ハーシーはデルブリュック達がリクルートしたファ-ジ・グループ最初のアメリカ人メンバー。 ワトソン自身はナポリでウィルキンスの講演を聞いた1951年(昭和26年)、すでにハーシー達の実験結果を知っていて、「DNAそのものの構造を議論すべき段階が来た」と考えていた。

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「高校生物基礎」遺伝子の本体=DNAの実験解説(グリフィス・エイブリー・ハーシーとチェイス)|高校生物の学び舎

ハーシー と チェイス の 実験

へ移動します。 ハーシー・チェイスの実験 渡辺は言う。 「3か年計画を考えた事自体が誤りで、あの時、ただちにウイルス増殖の研究に突入するべきだった」。 最初に渡辺が計画したのは、ファージの増殖を決定付ける因子がDNAである事の証明。 「1944年(昭和19年)に発表されたエイブリーの肺炎双球菌の実験から遺伝子の本体がDNAである事は明白だったから、そんな寄り道をするべきではなかったのに」。 渡辺達はナイトロジェン・マスタードでファージのDNA合成を止めた時と、フォルマリンでタンパク質合成を止めた時の違いから、遺伝子の本体がどちらか結論しようと考えた。 「しかし、それが結論された時に、次に何をすべきかを考えてはいなかった」。 「日本という片田舎の高慢ちきな青二才の鼻柱は、1952年(昭和27年)に発表されたアルフレッド・ハーシーとマーサ・チェイスの論文で無残に打ち砕かれた。 放射性アイソトープを使って、ファージが大腸菌に感染する時、DNAだけが中に入ってタンパク質は外に残る事を証明したのだ」。 リン原子は核酸にしか存在せず、イオウ原子はタンパク質にしかない。 二種の放射性アイソトープを使いわければ、どちらかだけを標識する事ができる。 大腸菌の中に入るのは、リン、すなわちDNAで、イオウ、すなわちタンパク質ではなかった。 ボーアや仁科達がはじめたトレーサー実験は、こんな革新的な結論を生んだのだ。 後に渡辺がワトソンに会った時、「研究する必要がなくなった時になって、どうしてウイルス増殖機構を研究しようとしたのか」と問われて、「返事に窮した」。 ハーシーはデルブリュック達がリクルートしたファ-ジ・グループ最初のアメリカ人メンバー。 ワトソン自身はナポリでウィルキンスの講演を聞いた1951年(昭和26年)、すでにハーシー達の実験結果を知っていて、「DNAそのものの構造を議論すべき段階が来た」と考えていた。

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【高校生物の物語】ウイルスの仕組み【ハーシーとチェイスの実験も】

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cshl. 彼はリンパ球から新しい物質を発見,ヌクレインと名付けた。 生体に重要なリンを含んでいた。 DNA デオキシリボ核酸)= 糖(デオキシリボース)+塩基+リン酸(ヌクレオチドを単位) 1920年〜1940年 遺伝物質はタンパク質と考えられていた。 なぜならタンパク質を構成するアミノ酸は20種類もあるのに,核酸には, 塩基が4種類しかない。 遺伝物質の複雑さを表現するのにふさわしくないと 思われたのだ。 1944年 アベリーの実験 肺炎双球菌には病原性のS型菌と非病原性のR型菌がある。 (SはSmooth,RはRoughの意味。 菌コロニーの表面の性質による) S型から核酸DNAを取り出し,タンパク質を取り出して,それぞれをR型菌に注入したところ, DNAを入れた菌がS型菌に転換した。 (形質転換) タンパク質を入れた方はR型のままだった。 この実験から遺伝子がDNAであることが分かった。 1952年 ハーシーとチェイス(米) バクテリオファージの一種、 T2ファージを使った研究により, タンパク質は遺伝物質となりえないこと、 遺伝物質がDNAであることを証明した 肺炎双球菌 図に描かれているように肺炎双球菌は丸い菌が二個並んで配列する細菌で,肺炎連鎖球菌または肺炎球菌ともいう。 ヒトに常在化している細菌のひとつで健康な人の上気道にも存在する。 周囲に多糖体でできた莢膜を持ち,これが病原性に関係するとともにワクチンとしても利用されている。 ヒトにも肺炎を起こし,乳幼児や高齢者は重症化しやすい。 R型とは培養基のコロニー表面が凸凹になることから,rough strainという意味で,S型はそれに対し,滑らかなsmooth strainを意味する。 決してsick(病気)型ではない。 グリフィスが形質転換を発見 英国の軍医であったフレデリック・グリフィスFrederick Griffith(1879-1941)は第一次世界大戦後に猛威をふるったスペイン風邪における肺炎を抑止しようとワクチン開発を試みているときに,肺炎双球菌で形質転換(transformation)を発見した。 米国の細菌学者オズワルド・エイブリー(アヴェリー)Oswald Avery 1877-1955 も最初はグリフィスの実験結果を信じなかった。 形質転換が起こったのでは,エイブリー自身が発見した免疫による細菌の分類がダメになるからだった。 (『分子生物学の夜明け』より) エイブリーの健闘 形質転換が追試などでも事実として確立すると,1930年代から1940年代にかけて一連の実験を行い,エイブリーと共同研究者のマックロイド MacLeod,そしてマッカーティMcCartyは形質転換を起こす物質を探し始めた。 物質の精製に十年がかかった。 エィブリーは慎重な性格で,1944年の論文では,この物質を「形質転換因子」と表現していて,DNAであると明確には書いていない。 1944年の論文 エイブリーの論文の共著者は医者であった。 急性の肺炎にきく抗血清をつくるというのが究極の目的だった。 グリフィスが形質転換を発見したのは1928年。 その翌年にはエイブリーのいたロックフェラー研究所でも追試された。 1931年にはエイブリーの研究室の研究員がマウスを使わないで実験を再現できることを示した。 S型菌をすりつぶしてろ紙で濾過し、ろ液をR型菌の培養液に加えると形質転換が起こった。 この液にエタノールを加えると粘っこい沈殿が生じた。 それから十年間、エイブリーは形質転換を起こす物質を精製していった。 初めは形質転換は起こったり起こらなかったりした。 しかし、最終的には確実に形質転換を起こすことができるようになった。 形質転換因子を抽出するために肺炎菌の汁からタンパク質を除く。 この当時は界面活性剤を使わず、クロロホルムを使っていたので抽出は手間のかかる作業だった。 エイブリーたちは得られた物質が何であるかということと、何でないかということを調べた。 形質転換因子はタンパク質の定性試験には陰性だったが、DNAの検出法には陽性だった。 タンパク質を分解する酵素は形質転換因子には影響しなかった。 DNAを溶かすようなものだけが因子の作用を消失させた。 免疫学的な試験でも因子のある抽出液にはタンパク質や莢膜が含まれていなかった。 慎重な実験の結果、形質転換因子をDNAと結論づけた。 形質転換因子の正体 形質転換を起こさせる物質がDNAであることは,エイブリーの実験で証明されたにもかかわらず,この業績は当時は正当に評価されなかった。 その理由は多くの科学者がDNAは遺伝子であるにはDNAの構成成分が単純すぎると考えていたからである。 DNAの塩基は4種類しかない。 タンパク質のほうがアミノ酸を20種類も使っている。 遺伝子の本体はタンパク質に違いないという先入観にとらわれていた。 また,細菌の遺伝学が新しい分野であり,細菌に遺伝子が存在するかどうかが明確でなかったせいもある。 ただし,ワトソンとクリックがDNAの構造に取り組んでいた1952年ころにはエイブリーの業績は正当に評価されていたという(ワトソン『DNA』より)。 ハーシーとチェイスの実験 アルフレッド・ハーシー Harsheyとマーサ・チェイスChaseの二人はコールド・スプリング・ハーバー研究所の研究者。 チェイスはハーシーの助手。 当時,細菌を攻撃するウィルス,つまりバクテリオファージの増殖を研究していたファージ・グループ(中心はインディアナ大学のルリアとデルブリュック)の考えではファージのタンパク質は細菌のなかへ入ってから遺伝的な役割をし, DNAはファージが細菌から出る前に付け加えられることになっていた。 しかし,ハーシーとチェイスは放射性同位元素を用いた研究で,DNAのマーカーとして 32P,タンパク質のマーカーとして 35Sを用いて,細菌の中に浸入するのは 32P,つまりDNAだけであることを証明した。 P(リン)はタンパク質には含まれず,S(硫黄)はDNAには含まれない元素である。 実験では取り付いたファージの殻を細菌からはがすというステップがうまくいかなかった。 初めてのことでどんな道具を使えばいいのか誰もわからなかったのだ。 偶然使われた道具は家庭用のミキサー(米名はウェアリング・ブレンダー)だった。 同僚の女性マーガレット・マクドナルドの助言で使ったミキサーが簡単にファージを大腸菌から引きはがした。 実験を成功させたこのミキサーは研究所の宝物として記念に保管されているという。 1952年のパリの国際生化学会議での二人の発表は大きなニュースになった。 形質転換因子,つまり遺伝子の本体はDNAだったのである。 (野島博『分子生物学の軌跡』より) バクテリオファージという奇妙な「生き物(?)」 バクテリア=細菌、ファージ=食べる者で、バクテリアに寄生するウィルスをバクテリオファージと呼ぶ。 大腸菌に寄生するバクテリオファージはT2と呼ばれた。 ハーシーが実験を思いついたヒントを与えたのは友人の電子顕微鏡学者トーマス・アンダーソンだった。 アンダーソンの撮影した電子顕微鏡写真によると、T2ファージにはDNAを入れるタンパク質の頭殻があり、それに細い足が付いていて、その足の先が細菌に付着している姿が写っていたのだ(1950年)。 細菌の表面についたファージのなかには、頭殻が空になったファージも見つかったという。 ハーシーは考えた。 もしそうならば、感染した細菌のなかにファージのDNAだけが入って生合成経路を操作する役割を果たしているのかもしれない。 どうしたらそれが証明できるだろうか。 ある日、ハーシーはタンパク質はSをもつがPを持たず、逆に核酸はPをもつがSをもたないことに気がついた。 培地を放射性同位元素で標識すればタンパク質と核酸を区別できるはずだ。 さっそく、助手のチェイスと放射能の取り込み実験をやってみると、簡単にPまたはSで標識されたファージが得られた。 方法の正しさを確信したハーシーは実験計画を建てて検証に取り組んだのだった。 シャルガフの塩基組成分析 二重らせん構造の相補性を発想する上でもっとも示唆に富んだデータはシャルガフの塩基分析であった。 % A T G C 酵母 31. 3 32. 9 18. 7 17. 1 コムギ胚 26. 8 28. 0 23. 2 22. 0 鶏赤血球 28. 8 29. 2 20. 5 21. 5 牛の精子 28. 6 27. 2 22. 2 22. 0 人の肝臓 30. 3 30. 3 19. 5 19. 9 表のデータから,どの生物においてもAとTの割合が等しく,GとCの割合が等しいことが分かる。 シャルガフ自身はDNAの構造については テトラヌクレオチド仮説を取ったが,これは誤りだった。 ライナス・ポーリングの仮説 DNAの構造を解明しようとしていたのはワトソンとクリックだけではなかった。 ライナス・ポーリングも研究していた。 ポーリングはワトソンらに先んじてDNAの三本鎖構造モデルを発表したが,ワトソンはそのモデルの核酸が「酸でなくなってしまっていた」ことに気づいたという (ワトソン『二重らせん』より)。 二重らせん構造は大化学者のポーリングにも思いつけなかった画期的なアイデアだったのだ。 X線回折による結晶分析 1950年頃,X線回折によってDNAの構造を研究している研究者は英国のキャンベディッシュ研究所のモーリス・ウィルキンス 1916-2004 とロザリンド・フランクリンだけだった。 ロザリンド・フランクリン(1920-1958)は1958年に亡くなったため,二重らせんのノーベル賞の受賞者にはならなかったものの,貢献度は大きかった。 ワトソンの『二重らせん』(1968年)には,フランクリンの撮った未公表の写真をウィルキンスに見せてもらった時のワトソンの驚きが書かれている。 B型DNA結晶の「その写真を見たとたん,口があき,脈が速くなった。 そのパターンは以前に得られたA型のものより信じられないほど単純なものだった。 さらに、写真の中心を占めている黒いクロスは、らせん構造からのみ生ずるものだった」と。 ちなみに,結晶の水分含量の違いでA型とB型があることはロージィ(彼女の愛称)の発見だった。 ロージィは数少ない女性科学者として気が強く,ワトソンらとは摩擦もあったが,科学者としての矜持から来るものであった。 DNAの構造についてロージィは二重らせんとは別の予測をしていたが,ワトソンとクリックの二重らせん構造を見た後ではその正しさを理解し,Natureの1953年の二重らせん構造発表と同じ号に二重らせん構造の正しさをX線回折の観点から補強する論文を投稿して掲載されている。 (ワトソン『二重らせん』より) クリックは2004年の7月に亡くなったが,その少し後の8月にウィルキンスが同じ年齢で亡くなった。 クリックの判断は正しかった 二重らせん構造の解明に当たってロザリンド・フランクリンが撮影したX線回折の写真を見て、らせんのピッチや直径などを構築するための計算がクリックには出来たのであった。 いや、極端にいえば、クリックにしか出来なかったと言っても過言ではないかもしれない。 なぜなら、その前年1952年にクリックは、らせんの理論の論文を書いていたからである。 X線回折像を解析するための一般式はフーリエ変換と呼ばれる複雑な式を使っていたが、高分子であるDNAが安定な構造を取るには「らせん構造」が最適と直感で信じたクリックは理論的にらせん構造をもつ物質のX線回折像を解く数式を求めようと考えていた。 ある日、クリックはデルタ関数を採用するというアイデアを思いついた。 デルタ関数とは、xにおいてのみ無限大の値を取り、他の点ではすべてゼロであり、それをマイナス無限大からプラス無限大まで積分すると1となるという奇妙な関数である。 これを一般式に代入すると複雑な項が消えてベッセル関数というすっきりした数式だけが残ったのである。 クリックの天才を証明する鮮やかで美しい解答であった。 ベッセル関数は太鼓を叩いたときに太鼓の表面に残る波を表現できる数式である。 この関数にらせんのピッチなどの数値を代入すると期待される回折像のパターンが表示される。 回折像からピッチを割り出す逆も真だった。 (野島博『分子生物学の軌跡』より) ワトソンに助言した化学者 最初のころ,ワトソンたちは塩基の構造をエノール型にして考察していた。 エノール型が普通だからである。 しかしケト型ではないかと助言した化学者ジェリー・ドノヒューがいる。 ケト型の塩基を用いると,あらゆる構造がぴったりだった。 DNAの複製法は鎖の片方が鋳型となって残る半保存的複製を示唆していた。 しかし,新しい鎖どうしが二重らせんを作る全保存的複製かもしれないし, 部分部分が新しい鎖になる分断的複製かもしれなかった。 たとえばマックス・デルブリュックはファスナーのように開いたら綺麗に分かれずに こんがらがってしまうのではないかと心配していた。 1957年,メセルソンとスタールによって半保存的複製が証明された。 当時開発されたばかりの超遠心機を用いて高分子を比重によって分離する 密度勾配遠心法を使っていた。 「生物学でもっとも美しい実験」とジョン・ケアンズ(当時コールド・スプリング・ ハーバー研究所長)は評価した。 窒素の同位体には重い窒素15Nと軽い窒素14Nがある。 一代目を重い窒素を含む溶液中で培養した大腸菌のDNAを抽出し, 残りを急に軽い窒素で育てた。 密度の違いで分離するのは塩化セシウム溶液が適当だった。 二代目はすべて重い窒素と軽い窒素の合いの子のDNAとなった。 三代めは「合いの子」DNAと軽いDNAが出来ていた。 みごとに半保存的複製が証明されていた 岡崎フラグメントの発見 (1967年,広島の被爆者だった岡崎令治による。 コーンバーグが発見した(1956年)。 名古屋大学の岡崎令治はDNAの鎖が逆並行なため,一方の鎖は開く先から新鎖が合成できるが,もう一方の鎖の合成は逆方向になるはずだとして研究をつづけ,不連続複製を証明した(1968年)。 逆方向のDNA鎖上ではRNAをプライマーとして短鎖(岡崎フラグメント)を不連続的に合成したのち,伸長しながらRNAを分解して一本の鎖に連結する。 DNAの複製の際にもRNAやたくさんの酵素が関わっていた。 『目でみるDNAのしくみ』(講談社)では詳しいアニメ動画で見ることができる。 岡崎令治(1930〜1975)は中学2年のとき,広島で黒い雨により被爆した。 1960年,ワシントン大学のココーンバーグのもとに留学。 スタンフォード大学を経て1963年,名古屋大学理学部化学教室に帰国。 1966年岡崎フラグメントを発見。 1972年,岡崎フラグメント間をつなぐRNAを見いだし,不連続合成モデルを完成させた。 被曝が元で慢性骨髄性白血病で米国旅行中に44歳で急逝した。 研究は夫人の恒子に引き継がれた。 DNAの二本の鎖のうち,転写され翻訳されてタンパク質を合成する暗号となるのは連続複製されるリーディング鎖だけである。 もう一方の不連続複製となるラギング鎖は転写されないと考えられてきた。 だが,アンチセンスRNAなど機能をもつ例も知られてきた。 DNAの複製が起こる時期 細胞周期の S期 (別ファイル) (生物基礎 「遺伝情報とRNA」) リボソームRNA 伝令RNA 核内にあり(1953年に発見,ハーシーによる) 1961年に機能が解明 運搬RNA(1956年発見) 細胞質基質 1965年にクローバー葉構造が解明(ホリーによる) T(チミン)の代わりにU( ウラシル),糖はリボース,1本鎖 (Central Dogma)。 DNA鎖の 片方だけがRNAに転写される。 DNAの塩基のTはRNAではUに置換している。 なぜなら、DNAの場所とタンパク質合成の場所は違っていたからである。 ・・・1955年にクリックはアミノ酸ごとに特定のアダプター分子(それ自体が小さなRNA分子)があり、それによってアミノ酸がタンパク質合成の場に運ばれると予想していた。 これは正しかった。 ・・・1956年、ブレナーは遺伝暗号の問題点を整理し、二つ組では不足、三つ組以上でなければならないと指摘していた、・・・そして、1961年、ブレナーとクリックは三つ組だという証拠を見つけた。 ・・・塩基の、ひとつや二つをのぞくとフレームシフトが起こるが、三つをのぞくと必ずしもタンパク質の活性は失われなかったのだ。 しかし、まだこのことを誰も知らなかった。 (ワトソン『DNA』より) ニレンバーグ(1961年)の実験 合成ポリU(ウラシル)を試験管内タンパク合成系で反応させたところ, フェニルアラニンが結合したポリペプチドが出来た。 同様の手法で次々に解読が進み,1968年までに暗号表は完成した。 ギャロッドの業績と一遺伝子一酵素説 遺伝子はどのように代謝過程を制御するのだろうか。 遺伝子が酵素を制御するという仮説は,遺伝学の歴史のかなり早い時期に提案されたが,最も注目すべき研究は,『先天代謝異常』(1908)という本を書いた英国の医師アーチボルド・ギャロッドによるものだ。 ギャロッドは稀な病気の子供に出会った。 この病気の症状のひとつは尿が空気に触れると暗褐色に変色することであった。 この症状は乳児のおむつですぐに分かった。 そこでこの病気はアルカプトヌーリア(黒い尿という意味。 日本語ではアルカプトン尿症)と呼ばれた。 ギャロッドはこの病気が両親が第一いとこの子供によく見られることに注目した。 メンデル遺伝が「再発見された」ばかりで,ギャロッドは第一いとこが対立遺伝子を共有し,子供に両親の稀な変異遺伝子が遺伝することを認識していたのだ。 彼はアルカプトン尿症は劣性の変異遺伝子による表現型だと報告した。 ギャロッドは第一段階の分析を開始。 症状の出た子供に生化学的な異常を認めた。 異常物質はホモゲンチジン酸で,血液や関節(結晶になりひどい痛みを伴った),尿(黒変の原因)に見られた。 ホモゲンチジン酸の化学構造はアミノ酸の一種チロシンに似ている。 ちょうど生体触媒としての酵素が発見されたばかりだった。 ギャロッドはホモゲンチジン酸はチロシンの分解産物だと提案した。 正常な場合にはホモゲンチジン酸は無害な物質に分解される。 ギャロッドによれば,正常なヒトの(野生型の)遺伝子は次のような化学変化を触媒する酵素の生合成を決定する。 結論としてギャロッドは1酵素に対する1遺伝子の関係one gene to one enzymeを認め,「生まれついての代謝の誤り inborn error of metabolism」という用語で表現し,生化学的な病気が遺伝的に決定されることを初めて記述した。 彼の仮説の検証には特異的な遺伝子の変異と酵素の直接の変化が必要だったが,健康な人のホモゲンチジン酸オキシダーゼがアルカプトン尿症の人では失活しているのが分かったのは1958年,この酵素をコードするDNAの変異が分かったのは1996年だった。 (ギャロッドの業績はLIFE第9版より) 米国のスタンフォード大学のビードルとテータムのアカパンカビを使った古典的な実験(1941)は遺伝子と酵素の関係が単純であること,すなわち一つの遺伝子は一つの酵素をコードすることを示した。 生物学の研究におけるモデル生物の重要性を認識させることとなった実験でもあった。 遺伝学と生化学が統合されて生まれたこの「1遺伝子1酵素説」により,ビードルとテータムには1958年度のノーベル賞が与えられた(レーダーバーグが細菌遺伝学への貢献で共同受賞した)。 現在は二つ,あるいはそれ以上の遺伝子でコードされる複数のポリペプチド鎖からなる酵素があることが知られているから,この原則をより正確に記述すれば「1遺伝子1ポリペプチド」となる。 現代のゲノム分析はポリペプチドをコードしない遺伝子や偽遺伝子の重要性を明らかにしつつある。 つまり遺伝子の概念がメンデルの時代とは変化しつつあるということである。 ALDH2が酔いに影響する) NN型(活性正常 Normal), アセトアルデヒドは速やかに代謝 ND型,NN型の16分の1の活性しかない DD型(不活性 Defect) 失活 テスト法:1cm角のろ紙または脱脂綿に70%エタノールをしませて, 腕の内側にテープで貼り付け5分。 はがして5分後に判定。 コントロールとして水分をしませたものを貼る。 悪性の貧血症で赤血球が鎌形に変形する。 (アフリカのマラリア発生地域と鎌形赤血球症の遺伝子分布には強い相関がある。 マラリアに感染しにくいのだ。 なぜヘモグロビンのアミノ酸が変化したのか。 DNAに突然変異が起こったから。 CTTの3番めの塩基Tが,CTAとアデニンに置換すると 指定するアミノ酸GluがValに変異する。 DNAのcode A A A C T A RNAのcodon U U U G A U 蛋白質 phe val あるいは CTTの中央の塩基Tが,CATとアデニンに置換しても 指定するアミノ酸GluがValに変異する。

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